效应面法优化甲巯咪唑聚乳酸
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【关键词】 重叠等高线图
摘要:目的 优化甲巯咪唑聚乳酸羟基乙酸共聚物微球的处方工艺。方法 采用O/O型乳化溶剂挥发法制备微球，通过Draper/lin小中心复合因子设计试验考察药物和PLGA的重量比、PLGA在内相的浓度、司盘－80在外相的浓度3个影响因子对微球的包封率、载药量和粒径的影响。根据最佳数学模型绘制效应面，通过重叠等高线图确定最优处方工艺。结果 3个影响因素和3个考察指标之间存在定量关系，优化处方工艺为药物和PLGA的重量比为0.08∶1，PLGA的浓度为40％，司盘的浓度为5％。优化处方各指标的预测值和目标值非常接近。结论 采用因子设计－效应面法完成了甲巯咪唑微球的多目标同步优化。
关键词:甲巯咪唑；微球；O/O型乳化溶剂挥发法；效应面法；重叠等高线图
Abstract: Objective To optimize the formulation of methimazoleloaded polylacticcoglycolic acid (PLGA) microspheres. Methods Methimazoleloaded PLGA microspheres were prepared by the oilinoil emulsion solvent evaporation technique. Three factors,including the weight ratio of drug to PLGA,PLGA concentration in internal phase and the emulsifier (Span 80) concentration in external phase,were known to be associated with the quality of the microspheres. A small composite design (Draper/Lin method) was used to investigate the effects of the three factors on encapsulation efficiency,drug loading and size distribution. Response surface and overlay contour plot were delineated according to the bestfit mathematic models. Optimum formulation was selected by overlay contour plot. Results The quantitative relationships between the three factors and three responses were obtained. The variables were optimized and the following processing conditions resulted in the highest drug loading and best yields of the microspheres: the weight ratio of drug to PLGA was 0.08:1,PLGA and Span 80 concentration was 40% and 5%,respectively. The predicted and observed values of the optimum formulation were in close agreement. Conclusion The multiobjective simultaneous optimization of the formulation of methimazoleloaded microspheres was obtained by response surface methodology.
Key words:methimazole; microspheres; oilinoil emulsion solvent evaporation; response surface methodology；overlay contour plot
生物可降解聚合物注射微球顺应了现代药剂学向长效、高效和低毒的发展方向，近三十年来一直是药剂学研究的热点之一。聚酯类高分子材料乳酸羟基乙酸共聚物(poly lacticcoglycolic acid,PLGA)在体内可最终代谢成水和二氧化碳，由于其良好的生物可降解性和相容性而备受研究者的青睐。关于PLGA微球制剂的报道涉及到各种不同药理活性的化合物如抗癌类药物、非甾体抗炎药物、抗早老性痴呆药物以及多肽类药物。从药物的溶解性质和分子量来看，制成微球制剂的药物多是一些水溶性差的小分子药物和水溶性的多肽类药物［1-3］，水溶性小分子药物由于不容易包封和控释效果不好，相关的报道较少。本课题以治疗甲亢的水溶性药物甲巯咪唑为模型药物，采用O/O型乳化溶剂挥发法制备PLGA微球，通过改进的部分因子设计和效应面法优化工艺，以期得到包封率和载药量较高、粒径适中的甲巯咪唑微球的制备工艺和处方。
1 材料与仪器
甲巯咪唑（江苏金坛市正丹化工厂，050602），PLGA（LA/GA为75∶25，分子量15 000，山东医疗器械研究所），二氯甲烷、液体石蜡、乙睛、正己烷（分析纯），司盘-80（天津市广成化学试剂有限公司）；数显式电动搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；UV―260型紫外分光光度计（日本岛津）；光学显微镜（OLYMPUS BX―50）。
2 方 法
2.1 甲巯咪唑微球的制备
按照一定比例称取甲巯咪唑和PLGA适量，溶于1 ml乙腈二氯甲烷（体积比2∶3）的混合溶剂中，滴入10 mL一定浓度的司盘－80溶液中，500 r/min乳化，搅拌4 h后，沉降，用正己烷洗涤微球，真空干燥24 h后，即得。
2.2 甲巯咪唑微球的载药量和包封率的测定
精密称取甲巯咪唑微球15 mg于10 mL离心管中，加入二氯甲烷1 mL，漩涡振荡2 min至微球完全溶解，加入水溶液5 mL，漩涡振荡2 min，2 500 r/min离心15 min ，取上清液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水溶液定容，得到供试溶液A。配制浓度约为1 mg・ml-1甲巯咪唑的二氯甲烷溶液，精密量取1 mL置于10 mL离心管中，同法操作，得到对照溶液B。252 nm测定吸收度，通过溶液A和溶液B的吸收度比值，计算微球的载药量。包封率为实际载药量和理论载药量的比值。
2.3 微球粒径的测定
采用光学显微镜观察微球的外观形态，测定不少于200个微球的粒径，计算算术平均粒径。
2.4 甲巯咪唑微球制备工艺和处方的优化
在一系列预示试验的基础上，固定某些因素的水平如内相的溶剂组成、外相和内相的体积比、搅拌速度等，采用SAS统计学软件ADX模块所提供的Draper/Lin方法设计试验，对药物和PLGA的重量比即理论载药量（X1）、PLGA在内相的浓度(X2)、司盘－80在外相的浓度(X3)3因子进行优化。考察指标（Y）为微球的包封率（Y1）、载药量（Y2）和粒径（Y3）。各因素水平的设置见表1，试验安排及结果见表2。表1 因子及水平（略）表2 Draper/Lin设计的试验安排及结果（略）
效应面法优化甲巯咪唑聚乳酸羟基乙酸共聚物微球的处方工艺Draper/Lin设计，又称为小中心复合设计（small center composite design），有的文献报道称Boxwilson设计是一种改进的部分因子设计［4］。它的设计表由两部分组成，上部分是一个二水平的部分因子设计表；下半部分包括5个中心对照点以及一组以因子数为空间维数，在坐标上关于原点对称的点（见表2）。表1中-1.414,-1,0,1,1.414分别代表5个水平，这种方式称为代码形式，最后的数据处理也可以用这些代码来进行。将优化后的结果代码换算成实验数值就可以得到所需的优化后的工艺参数。
采用SAS统计学软件通过以下模型对试验数据进行非线性拟合，以模型的R2和F检验结果，以及各因素的t检验结果作为模型拟合的判定标准。
Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+
b13X1X3+b11X22+b22X22+b33X23
Y表示考察指标，X1～X3代表影响因子，b0代表截距项，b代表各影响因子的系数。
3 结 果
3.1 甲巯咪唑微球含量测定的方法学考察
在ρ＝1～6 μg・mL-1范围内甲巯咪唑水溶液在252 nm处A与ρ有良好的线性关系。甲巯咪唑微球采用二氯甲烷溶解，用水提取后紫外检测的方法测定含量。空白微球在测定波长无紫外吸收，该测定方法在低（2 μg・mL-1）、中（4 μg・mL-1）、高（6 μg・mL-1）浓度的平均回收率为(100.56±0.52)％。
3.2 Draper/Lin设计试验结果
15批微球包封率、载药量和粒径的检测结果见表2，试验数据的模型拟合结果见表3。根据拟合方程将次要的因素固定在某一水平，绘制影响因素和各考察指标响应值的三维图见图1～3。表3 模型拟合的结果（略）
3.2.1 影响包封率的主要因素
从表3和图1可以看出影响包封率的主要因素是PLGA的浓度、药物和载体的比例（理论载药量），其中前者的影响更大，随着PLGA浓度的增加，微球的包封率最多可增加近40％。
3.2.2 影响载药量的主要因素
PLGA的浓度和理论载药量都会显著的影响微球的载药量，其中理论载药量的影响力更强。但是增加药物和载体质量比在提高微球实际载药量的同时，包封率会有所降低。
3.2.3 影响微球粒径的主要因素
PLGA的浓度和司盘的浓度都会影响微球的粒径，其中司盘的影响更大。从图3 可以看出随着两者与粒径呈现出明显的非线性的相关性。当X3≈0.5,X2≈-0.5，微球的粒径最小。当司盘的浓度处在较低的水平时（如X3<0.5），随着司盘浓度的增加，由于乳化能力增加，微球的粒径降低。当司盘的浓度处在较高的水平（如X3>0.5），随着司盘浓度的增加，微球的粒径有增加的趋势，这是因为增加司盘的浓度会在一定程度上增加体系的黏度，乳化所需要的剪切力增大。PLGA浓度对粒径的影响也与PLGA所处的水平有关。当PLGA浓度较低时，浓度对粒径的影响较小；当PLGA的浓度较高时，随着PLGA浓度的增加，微球的粒径增加。这主要有两方面原因首先是随着PLGA浓度的增加溶液的黏度增加，乳化所需的剪切力增加，其次是随着PLGA浓度的增加，微球的固化时间加快，乳滴来不及分散成更小的微粒。
3.3 处方优化
理想的甲巯咪唑微球在具有较高包封率的同时，也应具有较高的载药量，此外为了保证微球具有良好的通针性粒径也不应太大。结合试验结果确定了优化指标的目标值为：包封率不低于80％，载药量为5％～10％，平均粒径在45～55 μm范围内。将X3的水平固定在0，即司盘在外相的浓度为5％，绘制因素X1和X2对指标Y1~Y3的重叠等高线图，得到了能同时满足上述条件的优化区域（见图4）。从优化区域中选定X1和X2的水平分别为-0.57和0.47，即优化处方工艺为药物和PLGA的重量比为0.08∶1，PLGA的浓度为40％，司盘的浓度为5％。表4 优化处方的预测值和实测值（略）
根据优化的处方工艺制备甲巯咪唑微球，并测定包封率、载药量和粒径，结果显示实测值和预测值非常接近，采用效应面法多目标同步优化甲巯咪唑微球的处方工艺达到了预期的效果。
4 讨 论
4．1 乳化溶剂挥发法包括两个最基本的过程即乳化和溶剂挥发过程，影响溶剂挥发速度和程度的因素如乳化剂的用量、载体的浓度、内外相的体积等都会影响到微球的性质（形态、粒径、载药量、包封率和释药曲线）。而这些因素的影响作用是复杂的，不是简单的线性关系，各因素所处的水平直接关系到其对考察指标影响的方式和大小，因此在处方工艺优化时我们需要选择一种多水平的实验设计Draper/Lin设计。这种改进的部分因子设计法考察的水平数多，试验次数少，比正交设计和均匀设计更科学和可靠。
4．2 微球的处方工艺常涉及到多指标同步优化的问题，过去多采用综合评分法处理，这种方法比较粗糙而且主观性较强，目前比较科学和先进的优化方法是根据效应曲线的图像进行判别［5，6］。本文通过中心复合设计效应面法建立了三个影响因素（药物和PLGA的重量比、PLGA在内相的浓度、司盘在外相的浓度）与三个考察指标响应值（包封率、载药量和粒径）的数学模型，采用重叠等高线法实现了微球的多指标优化，这种优化的方法值得在新型给药系统的工艺筛选研究中进一步推广。
参考文献:
［1］KYO M,HYON S H,IKADA Y. Effects of preparation conditions of cisplatinloaded microspheres on the in vitro release［J］.J Control Release,1995,35：73.
［2］YANG Y Y,CHUNG T S. Morphology,drug distribution,and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by doubleemulsion solvent extraction /evaporation method［J］.Biomaterials,2001,22 (3): 231.
［3］HAN K,LEE K D,GAO Z G,et al. Preparation and evaluation of poly (Llactic acid)microspheres containin rhEGF for chronic gastric ulcer healing ［J］. J of Controlled Release,2001,75 (3):259.
［4］平其能.现代药剂学［M］.北京：中国医药卫生出版社，2000:212
［5］陆兵，徐国杰，张汝华.纳曲酮植入剂体外处方优化［J］.中国药学杂志，2000，35（7）：452
［6］吴涛，潘卫三，陈济民，等.多目标同步优化硫酸沙丁胺醇渗透泵控释片的制备工艺［J］.药学学报，2002，35（8）：617.
摘要:目的 优化甲巯咪唑聚乳酸羟基乙酸共聚物微球的处方工艺。方法 采用O/O型乳化溶剂挥发法制备微球，通过Draper/lin小中心复合因子设计试验考察药物和PLGA的重量比、PLGA在内相的浓度、司盘－80在外相的浓度3个影响因子对微球的包封率、载药量和粒径的影响。根据最佳数学模型绘制效应面，通过重叠等高线图确定最优处方工艺。结果 3个影响因素和3个考察指标之间存在定量关系，优化处方工艺为药物和PLGA的重量比为0.08∶1，PLGA的浓度为40％，司盘的浓度为5％。优化处方各指标的预测值和目标值非常接近。结论 采用因子设计－效应面法完成了甲巯咪唑微球的多目标同步优化。
关键词:甲巯咪唑；微球；O/O型乳化溶剂挥发法；效应面法；重叠等高线图
Abstract: Objective To optimize the formulation of methimazoleloaded polylacticcoglycolic acid (PLGA) microspheres. Methods Methimazoleloaded PLGA microspheres were prepared by the oilinoil emulsion solvent evaporation technique. Three factors,including the weight ratio of drug to PLGA,PLGA concentration in internal phase and the emulsifier (Span 80) concentration in external phase,were known to be associated with the quality of the microspheres. A small composite design (Draper/Lin method) was used to investigate the effects of the three factors on encapsulation efficiency,drug loading and size distribution. Response surface and overlay contour plot were delineated according to the bestfit mathematic models. Optimum formulation was selected by overlay contour plot. Results The quantitative relationships between the three factors and three responses were obtained. The variables were optimized and the following processing conditions resulted in the highest drug loading and best yields of the microspheres: the weight ratio of drug to PLGA was 0.08:1,PLGA and Span 80 concentration was 40% and 5%,respectively. The predicted and observed values of the optimum formulation were in close agreement. Conclusion The multiobjective simultaneous optimization of the formulation of methimazoleloaded microspheres was obtained by response surface methodology.
Key words:methimazole; microspheres; oilinoil emulsion solvent evaporation; response surface methodology；overlay contour plot
生物可降解聚合物注射微球顺应了现代药剂学向长效、高效和低毒的发展方向，近三十年来一直是药剂学研究的热点之一。聚酯类高分子材料乳酸羟基乙酸共聚物(poly lacticcoglycolic acid,PLGA)在体内可最终代谢成水和二氧化碳，由于其良好的生物可降解性和相容性而备受研究者的青睐。关于PLGA微球制剂的报道涉及到各种不同药理活性的化合物如抗癌类药物、非甾体抗炎药物、抗早老性痴呆药物以及多肽类药物。从药物的溶解性质和分子量来看，制成微球制剂的药物多是一些水溶性差的小分子药物和水溶性的多肽类药物［1-3］，水溶性小分子药物由于不容易包封和控释效果不好，相关的报道较少。本课题以治疗甲亢的水溶性药物甲巯咪唑为模型药物，采用O/O型乳化溶剂挥发法制备PLGA微球，通过改进的部分因子设计和效应面法优化工艺，以期得到包封率和载药量较高、粒径适中的甲巯咪唑微球的制备工艺和处方。
1 材料与仪器
甲巯咪唑（江苏金坛市正丹化工厂，050602），PLGA（LA/GA为75∶25，分子量15 000，山东医疗器械研究所），二氯甲烷、液体石蜡、乙睛、正己烷（分析纯），司盘-80（天津市广成化学试剂有限公司）；数显式电动搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；UV―260型紫外分光光度计（日本岛津）；光学显微镜（OLYMPUS BX―50）。
2 方 法
2.1 甲巯咪唑微球的制备
按照一定比例称取甲巯咪唑和PLGA适量，溶于1 ml乙腈二氯甲烷（体积比2∶3）的混合溶剂中，滴入10 mL一定浓度的司盘－80溶液中，500 r/min乳化，搅拌4 h后，沉降，用正己烷洗涤微球，真空干燥24 h后，即得。
2.2 甲巯咪唑微球的载药量和包封率的测定
精密称取甲巯咪唑微球15 mg于10 mL离心管中，加入二氯甲烷1 mL，漩涡振荡2 min至微球完全溶解，加入水溶液5 mL，漩涡振荡2 min，2 500 r/min离心15 min ，取上清液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水溶液定容，得到供试溶液A。配制浓度约为1 mg・ml-1甲巯咪唑的二氯甲烷溶液，精密量取1 mL置于10 mL离心管中，同法操作，得到对照溶液B。252 nm测定吸收度，通过溶液A和溶液B的吸收度比值，计算微球的载药量。包封率为实际载药量和理论载药量的比值。
2.3 微球粒径的测定
采用光学显微镜观察微球的外观形态，测定不少于200个微球的粒径，计算算术平均粒径。
2.4 甲巯咪唑微球制备工艺和处方的优化
在一系列预示试验的基础上，固定某些因素的水平如内相的溶剂组成、外相和内相的体积比、搅拌速度等，采用SAS统计学软件ADX模块所提供的Draper/Lin方法设计试验，对药物和PLGA的重量比即理论载药量（X1）、PLGA在内相的浓度(X2)、司盘－80在外相的浓度(X3)3因子进行优化。考察指标（Y）为微球的包封率（Y1）、载药量（Y2）和粒径（Y3）。各因素水平的设置见表1，试验安排及结果见表2。表1 因子及水平（略）表2 Draper/Lin设计的试验安排及结果（略）
效应面法优化甲巯咪唑聚乳酸羟基乙酸共聚物微球的处方工艺Draper/Lin设计，又称为小中心复合设计（small center composite design），有的文献报道称Boxwilson设计是一种改进的部分因子设计［4］。它的设计表由两部分组成，上部分是一个二水平的部分因子设计表；下半部分包括5个中心对照点以及一组以因子数为空间维数，在坐标上关于原点对称的点（见表2）。表1中-1.414,-1,0,1,1.414分别代表5个水平，这种方式称为代码形式，最后的数据处理也可以用这些代码来进行。将优化后的结果代码换算成实验数值就可以得到所需的优化后的工艺参数。
采用SAS统计学软件通过以下模型对试验数据进行非线性拟合，以模型的R2和F检验结果，以及各因素的t检验结果作为模型拟合的判定标准。
Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b12X1X2+b23X2X3+
b13X1X3+b11X22+b22X22+b33X23
Y表示考察指标，X1～X3代表影响因子，b0代表截距项，b代表各影响因子的系数。
3 结 果
3.1 甲巯咪唑微球含量测定的方法学考察
在ρ＝1～6 μg・mL-1范围内甲巯咪唑水溶液在252 nm处A与ρ有良好的线性关系。甲巯咪唑微球采用二氯甲烷溶解，用水提取后紫外检测的方法测定含量。空白微球在测定波长无紫外吸收，该测定方法在低（2 μg・mL-1）、中（4 μg・mL-1）、高（6 μg・mL-1）浓度的平均回收率为(100.56±0.52)％。
3.2 Draper/Lin设计试验结果
15批微球包封率、载药量和粒径的检测结果见表2，试验数据的模型拟合结果见表3。根据拟合方程将次要的因素固定在某一水平，绘制影响因素和各考察指标响应值的三维图见图1～3。表3 模型拟合的结果（略）
3.2.1 影响包封率的主要因素
从表3和图1可以看出影响包封率的主要因素是PLGA的浓度、药物和载体的比例（理论载药量），其中前者的影响更大，随着PLGA浓度的增加，微球的包封率最多可增加近40％。
3.2.2 影响载药量的主要因素
PLGA的浓度和理论载药量都会显著的影响微球的载药量，其中理论载药量的影响力更强。但是增加药物和载体质量比在提高微球实际载药量的同时，包封率会有所降低。
3.2.3 影响微球粒径的主要因素
PLGA的浓度和司盘的浓度都会影响微球的粒径，其中司盘的影响更大。从图3 可以看出随着两者与粒径呈现出明显的非线性的相关性。当X3≈0.5,X2≈-0.5，微球的粒径最小。当司盘的浓度处在较低的水平时（如X3<0.5），随着司盘浓度的增加，由于乳化能力增加，微球的粒径降低。当司盘的浓度处在较高的水平（如X3>0.5），随着司盘浓度的增加，微球的粒径有增加的趋势，这是因为增加司盘的浓度会在一定程度上增加体系的黏度，乳化所需要的剪切力增大。PLGA浓度对粒径的影响也与PLGA所处的水平有关。当PLGA浓度较低时，浓度对粒径的影响较小；当PLGA的浓度较高时，随着PLGA浓度的增加，微球的粒径增加。这主要有两方面原因首先是随着PLGA浓度的增加溶液的黏度增加，乳化所需的剪切力增加，其次是随着PLGA浓度的增加，微球的固化时间加快，乳滴来不及分散成更小的微粒。
3.3 处方优化
理想的甲巯咪唑微球在具有较高包封率的同时，也应具有较高的载药量，此外为了保证微球具有良好的通针性粒径也不应太大。结合试验结果确定了优化指标的目标值为：包封率不低于80％，载药量为5％～10％，平均粒径在45～55 μm范围内。将X3的水平固定在0，即司盘在外相的浓度为5％，绘制因素X1和X2对指标Y1~Y3的重叠等高线图，得到了能同时满足上述条件的优化区域（见图4）。从优化区域中选定X1和X2的水平分别为-0.57和0.47，即优化处方工艺为药物和PLGA的重量比为0.08∶1，PLGA的浓度为40％，司盘的浓度为5％。表4 优化处方的预测值和实测值（略）
根据优化的处方工艺制备甲巯咪唑微球，并测定包封率、载药量和粒径，结果显示实测值和预测值非常接近，采用效应面法多目标同步优化甲巯咪唑微球的处方工艺达到了预期的效果。
4 讨 论
4．1 乳化溶剂挥发法包括两个最基本的过程即乳化和溶剂挥发过程，影响溶剂挥发速度和程度的因素如乳化剂的用量、载体的浓度、内外相的体积等都会影响到微球的性质（形态、粒径、载药量、包封率和释药曲线）。而这些因素的影响作用是复杂的，不是简单的线性关系，各因素所处的水平直接关系到其对考察指标影响的方式和大小，因此在处方工艺优化时我们需要选择一种多水平的实验设计Draper/Lin设计。这种改进的部分因子设计法考察的水平数多，试验次数少，比正交设计和均匀设计更科学和可靠。
4．2 微球的处方工艺常涉及到多指标同步优化的问题，过去多采用综合评分法处理，这种方法比较粗糙而且主观性较强，目前比较科学和先进的优化方法是根据效应曲线的图像进行判别［5，6］。本文通过中心复合设计效应面法建立了三个影响因素（药物和PLGA的重量比、PLGA在内相的浓度、司盘在外相的浓度）与三个考察指标响应值（包封率、载药量和粒径）的数学模型，采用重叠等高线法实现了微球的多指标优化，这种优化的方法值得在新型给药系统的工艺筛选研究中进一步推广。
参考文献:
［1］KYO M,HYON S H,IKADA Y. Effects of preparation conditions of cisplatinloaded microspheres on the in vitro release［J］.J Control Release,1995,35：73.
［2］YANG Y Y,CHUNG T S. Morphology,drug distribution,and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by doubleemulsion solvent extraction /evaporation method［J］.Biomaterials,2001,22 (3): 231.
［3］HAN K,LEE K D,GAO Z G,et al. Preparation and evaluation of poly (Llactic acid)microspheres containin rhEGF for chronic gastric ulcer healing ［J］. J of Controlled Release,2001,75 (3):259.
［4］平其能.现代药剂学［M］.北京：中国医药卫生出版社，2000:212
［5］陆兵，徐国杰，张汝华.纳曲酮植入剂体外处方优化［J］.中国药学杂志，2000，35（7）：452
［6］吴涛，潘卫三，陈济民，等.多目标同步优化硫酸沙丁胺醇渗透泵控释片的制备工艺［J］.药学学报，2002，35（8）：617.
