HPLC测定覆盆子中金丝桃苷的含量
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【摘要】 目的 建立覆盆子中金丝桃苷的含量测定方法。方法 采用HPLC法。SinoChrom ODS BP色谱柱（5µm，4.6×250mm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15:85），检测波长：360nm。结果 金丝桃苷浓度线性范围0.00506~0.1012mg/ mL，r =0.99994；样品平均回收率为98.77%，RSD=1.57%（n=6）。结论 该方法简便、准确、重现性好，可用于该中药的含量测定。
【关键词】覆盆子 金丝桃苷 HPLC 药学
【Abstract】 Objective To establish a method to determine Hyperin in Rubi Fructus.Methods A HPLC method was used. Chromatographic assay was performed on a SinoChrom ODS BP(5µm，4.6×250mm）column.The mobile phrase consisted of acetonitile-0.1% phosphoric（15:85）,the detection wavelength was set at 360nm.Results The linear range of Hyperin was from 0.00506 to 0.1012mg/ mL and correlation coefficient was 0.99994.The average recovery of Hyperin was 98.77% and RSD was 1.57 %（n=6）.Conclusion The method is simple ,accurate and reproducible for the determination of Hyperin in Rubi Fructus.
【Key words】 Rubi Fructus Hyperin HPLC
覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实，有益肾固精缩尿、养肝明目的功效，用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花。覆盆子果实中含有三萜类成分，覆盆子酸，鞣花酸，椴树苷，胡萝卜苷[1]，另有文献报道，尚含黄酮化合物[2,3]。由于覆盆子基础研究薄弱，2010年版《中国药典（一部）》中仅有性状鉴别和显微鉴别[4]。目前已有椴树苷的HPLC含测方法报道[5]，但尚无覆盆子中的金丝桃苷定量测定的文献。本实验采用HPLC法对其进行了含量测定，结果表明，该方法快速简捷、重现性好，取得了满意的结果。
1 实验部分
1.1 仪器与试药
HP-Agilent1100型高效液相色谱仪，包括G1322A真空脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1365A多波长检测器，LGC-1025M柱温箱，HP Rev.A.07.01色谱工作站；BP211D型1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司）；250超声波清洗器（上海）。
金丝桃苷对照品（供含测用，中国药品生物制品检定所提供，批号：111521-200303）。乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
覆盆子Rubi Fructus，经鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实。
1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件与系统适用性考察[6]
色谱柱：SinoChrom ODS BP（5µm，4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15:85）；流速：1mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10µL；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于5000。
1-金丝桃苷 1-Hyperin
图1 对照品（A）和样品（B）的色谱图
Fig.1 Chromatograms of reference substance（A）and sample（B）
1.2.2 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷对照品10.12mg，置100mL量瓶中，加80%甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取2mL，置10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2.3 供试品溶液的制备[6]
取本品粉末（过四号筛）1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250w，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，加80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.4 线性关系考察
精密吸取“1.2.2” 项制备的对照品贮备液0.5，1，2，3，5，10mL，置10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述溶液10µL，按“1.2.1”项色谱条件测定，以进样浓度为横坐标（X：mg/mL），峰面积积分值为纵坐标（Y ：mAU*s），进行线性回归，得回归方程：Y = 208.3 1X - 0.0134，r = 0.999 94。结果表明，金丝桃苷在0.00506~0.1012mg/mL的范围内呈良好线性关系。
1.2.5 精密度试验
精密吸取“1.2.2”项下制备的对照品溶液10µL，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD=0.22%，表明本法精密度良好。
1.2.6 稳定性试验
取供试品溶液于制备后0、2、4、6、8、10h进样，金丝桃苷峰面积的RSD=0.59%，表明供试品溶液在10h内稳定。
1.2.7 重复性试验
称取同一批样品6份，按“1.2.3”项下方法处理并测定含量，结果金丝桃苷RSD=1.17%，表明此方法重复性较好。
1.2.8 回收率试验
称取已知含量的样品6份，分别精密加入一定量的对照品，按“1.2.3”项下方法处理并测定含量，分别计算样品加样回收率（结果见表1），平均回收率为98.77%，RSD=1.57%。
表1 金丝桃苷回收率试验结果
2 讨论与总结
2.1 流动相的选择
本实验通过对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等多种不同比例的流动相进行比较试验，结果乙腈-0.1%磷酸溶液比例为15:85的系统分离效果较好，且峰形较好，故选择本系统为流动相。
2.2 含量测定的讨论
本实验中1.2.9样品的含量测定中第二批的含量和其它两批含量差异较显著，分析原因可能与覆盆子来源不同有关系，因此，仍需做大量实验来验证。
2.3 含量与功效的关系
本实验确定了覆盆子中的黄酮类化合物为金丝桃苷，但是金丝桃苷含量的高低与覆盆子的功效之间的联系仍不明确，还有待进一步研究。
参考文献
[1] 常新全，丁丽霞．中药活性成分分析手册[M]．北京：学苑出版社，2002,1877
[2] 苗菊茹，谢一辉，刘红宁．覆盆子的研究进展[J]．江西中医药，2004,1,1
[3] 刘劲松，王刚，王国凯．覆盆子化学成分研究[J]．中国中医药科技，2008,5, 15( 3): 197-199
[4] 中国药典[S]．一部，2010,359
[5] 虞金宝，吕武清，彭宏俊等．覆盆子中椴树苷的含量测定研究[J]．药物研究，2008,17(23):8-9
【关键词】覆盆子 金丝桃苷 HPLC 药学
【Abstract】 Objective To establish a method to determine Hyperin in Rubi Fructus.Methods A HPLC method was used. Chromatographic assay was performed on a SinoChrom ODS BP(5µm，4.6×250mm）column.The mobile phrase consisted of acetonitile-0.1% phosphoric（15:85）,the detection wavelength was set at 360nm.Results The linear range of Hyperin was from 0.00506 to 0.1012mg/ mL and correlation coefficient was 0.99994.The average recovery of Hyperin was 98.77% and RSD was 1.57 %（n=6）.Conclusion The method is simple ,accurate and reproducible for the determination of Hyperin in Rubi Fructus.
【Key words】 Rubi Fructus Hyperin HPLC
覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实，有益肾固精缩尿、养肝明目的功效，用于治疗遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花。覆盆子果实中含有三萜类成分，覆盆子酸，鞣花酸，椴树苷，胡萝卜苷[1]，另有文献报道，尚含黄酮化合物[2,3]。由于覆盆子基础研究薄弱，2010年版《中国药典（一部）》中仅有性状鉴别和显微鉴别[4]。目前已有椴树苷的HPLC含测方法报道[5]，但尚无覆盆子中的金丝桃苷定量测定的文献。本实验采用HPLC法对其进行了含量测定，结果表明，该方法快速简捷、重现性好，取得了满意的结果。
1 实验部分
1.1 仪器与试药
HP-Agilent1100型高效液相色谱仪，包括G1322A真空脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1365A多波长检测器，LGC-1025M柱温箱，HP Rev.A.07.01色谱工作站；BP211D型1/10万电子分析天平（德国Sartorius公司）；250超声波清洗器（上海）。
金丝桃苷对照品（供含测用，中国药品生物制品检定所提供，批号：111521-200303）。乙腈（色谱纯，美国Tedia公司），水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
覆盆子Rubi Fructus，经鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果实。
1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件与系统适用性考察[6]
色谱柱：SinoChrom ODS BP（5µm，4.6×250mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15:85）；流速：1mL/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10µL；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于5000。
1-金丝桃苷 1-Hyperin
图1 对照品（A）和样品（B）的色谱图
Fig.1 Chromatograms of reference substance（A）and sample（B）
1.2.2 对照品溶液的制备
精密称取金丝桃苷对照品10.12mg，置100mL量瓶中，加80%甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取2mL，置10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2.3 供试品溶液的制备[6]
取本品粉末（过四号筛）1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250w，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，加80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.2.4 线性关系考察
精密吸取“1.2.2” 项制备的对照品贮备液0.5，1，2，3，5，10mL，置10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取上述溶液10µL，按“1.2.1”项色谱条件测定，以进样浓度为横坐标（X：mg/mL），峰面积积分值为纵坐标（Y ：mAU*s），进行线性回归，得回归方程：Y = 208.3 1X - 0.0134，r = 0.999 94。结果表明，金丝桃苷在0.00506~0.1012mg/mL的范围内呈良好线性关系。
1.2.5 精密度试验
精密吸取“1.2.2”项下制备的对照品溶液10µL，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD=0.22%，表明本法精密度良好。
1.2.6 稳定性试验
取供试品溶液于制备后0、2、4、6、8、10h进样，金丝桃苷峰面积的RSD=0.59%，表明供试品溶液在10h内稳定。
1.2.7 重复性试验
称取同一批样品6份，按“1.2.3”项下方法处理并测定含量，结果金丝桃苷RSD=1.17%，表明此方法重复性较好。
1.2.8 回收率试验
称取已知含量的样品6份，分别精密加入一定量的对照品，按“1.2.3”项下方法处理并测定含量，分别计算样品加样回收率（结果见表1），平均回收率为98.77%，RSD=1.57%。
表1 金丝桃苷回收率试验结果
2 讨论与总结
2.1 流动相的选择
本实验通过对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等多种不同比例的流动相进行比较试验，结果乙腈-0.1%磷酸溶液比例为15:85的系统分离效果较好，且峰形较好，故选择本系统为流动相。
2.2 含量测定的讨论
本实验中1.2.9样品的含量测定中第二批的含量和其它两批含量差异较显著，分析原因可能与覆盆子来源不同有关系，因此，仍需做大量实验来验证。
2.3 含量与功效的关系
本实验确定了覆盆子中的黄酮类化合物为金丝桃苷，但是金丝桃苷含量的高低与覆盆子的功效之间的联系仍不明确，还有待进一步研究。
参考文献
[1] 常新全，丁丽霞．中药活性成分分析手册[M]．北京：学苑出版社，2002,1877
[2] 苗菊茹，谢一辉，刘红宁．覆盆子的研究进展[J]．江西中医药，2004,1,1
[3] 刘劲松，王刚，王国凯．覆盆子化学成分研究[J]．中国中医药科技，2008,5, 15( 3): 197-199
[4] 中国药典[S]．一部，2010,359
[5] 虞金宝，吕武清，彭宏俊等．覆盆子中椴树苷的含量测定研究[J]．药物研究，2008,17(23):8-9