大白菜黑斑病室内苗期抗性鉴定方法的研究
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摘要：为了选育大白菜（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.） Olsson）抗黑斑病（Alternaria brassicae）新品种和种质创新，在室内利用6个品种的大白菜研究了接种物浓度、苗龄和温度对大白菜黑斑病发病的影响，结果表明，在（25±1）℃光照培养室内，选择浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗，保湿24～48 h，10 d后进行病情调查，可对大白菜种质资源抗黑斑病的抗性进行正确评价。
关键词：大白菜（Brassica campestris L. ssp pekinensis （Lour.） Olsson）；黑斑病（Alternaria brassicae）；苗期；抗性鉴定
Study on Resistance Identification Method for Black Spot of Chinese Cabbage at Seedling Stage in Laboratory
GAN Cai-xia1，ZHU Hua2，CUI Lei1，YUAN Wei-ling1，GAO Xiang1，FU Yi-bin1，MEI Shi-yong1
（1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China；
2. Wuhan Vegetable Technical Service Station， Wuhan 430012，China）
Abstract： In order to provide technical support for breeding new varieties and germplasm innovation of Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.） Olsson） with resistance to black spot（Alternaria brassicae）， the influence of inoculation spore concentration， seedling stage and temperature on black spot occurrence was studied with six varieties. It was showed that by spraying 1.0×104 pfu/mL or 1.0×105 pfu/mL spore suspension on seedling at 3～4 leaf stage and then moisturizing for 24～48 h at （25±1）℃ in door， the resistance of radish varieties on the black spot could be accurately evaluated 10 d after inoculation.
Key words： Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.）Olsson）；black spot（Alternaria brassicae）；seedling stage； resistance identification
大白菜黑斑病是由链格孢属真菌所致的一种常发性病害，病原菌包括芸薹链格孢（Alternaria brassicae （Berk.） Sacc.），甘蓝链格孢（A. brassicicola）和萝卜链格孢（A. japonica）3个种，其中秋冬白菜黑斑病一般由芸薹链格孢引起，而春夏白菜黑斑病则主要由甘蓝链格孢引起，是一种世界性的重要病害，最早于1836年在甘蓝上发现，1934年开始有为害大白菜的记录[1]。大白菜黑斑病主要通过种子传代形成异地扩散和蔓延，危害叶片和整株植物，全生育过程发病，严重影响白菜产量和质量，成为大白菜生产的主要病害之一，尤其在美国、芬兰、加拿大、中国台湾发生较重[2，3]。我国最早在1919年于广东省的甘蓝上发现，1937年江苏报道其为害大白菜。20世纪70年代末，黑斑病在我国大白菜等十字花科蔬菜上逐渐严重起来[4]。
大白菜黑斑病主要危害叶片、叶柄及种荚。在真叶上，最初形成圆形退绿斑，病斑扩大后转为暗黑色。全株叶片由外向内干枯，有明显较稀的同心轮纹，边缘有黄色晕环。潮湿时病斑有一层黑霉。近年来，随着春大白菜、早秋大白菜的发展，黑斑病病害问题日益突出，抗病育种是解决大白菜黑斑病经济而又有效的途径，而抗性鉴定则是抗病育种的基础[5]。
国内外对白菜黑斑病的研究主要集中在黑斑病的发生和危害、寄主植物的抗性、流行病学因素、病原物生物学特性和病原物毒素研究及综合防治等方面[6]。对于白菜黑斑病，北京市植保所李明远[7]进行了广泛深入的研究。1989年樊慕贞等[8]对河北省白菜黑斑病发生规律及防治进行了研究。而对白菜黑斑病鉴定方法的研究目前还比较少见，急需一种快速、简便而又精确的抗性鉴定方法，对我国大白菜种质资源进行筛选，以期建立简单、快速的品种选育流程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试黑斑病菌种（BHB）采自湖北省农业科学院蔬菜科技中心试验基地。菌种接种前用PDA碳源减半（马铃薯200 g，葡萄糖/蔗糖5 g，琼脂15 g，pH 7.0，去离子水1 000 mL） 固体培养基进行培养。
供试大白菜品种为湖北省农业科学院蔬菜科技中心提供，分别为品种1、品种2、品种3、品种4、品种5、品种6六种类型大白菜品种。
将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆（8 cm×8 cm）内，出苗后每盆留1～3株。
1.2 试验方法
1.2.1 环境的选择 在抗病育种过程中，大田期对黑斑病进行抗性鉴定往往由于气候条件不适宜发病而无法进行，而苗期在室内进行鉴定则温湿度条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。为此，进行了室内苗期鉴定萝卜黑斑病抗性的研究，以找出更适于苗期抗病性鉴定的方法，确定苗期黑斑病适宜的诱导发病条件，并用筛选出的最适方法对大白菜种质资源进行苗期抗病性鉴定和分级，获得抗黑斑病材料。
1.2.2 影响因素的选择 为选择一个好的抗性鉴定方法，根据各国学者在这方面进行了系统研究，即选择从接种物浓度、苗龄、环境温度等各方面探讨影响大白菜黑斑病抗性鉴定的因素[9]。
1.2.3 接种方法的选择 接种方法包括拌种法、浸种法、土壤接种法、蘸根接种法、根部切伤接种法、喷雾法和针刺法[10]。在确定以接种物浓度、苗龄和温度这3个因素为变量的情况下，选择喷雾法对大白菜苗进行接种。
1.3 接种
将BHB菌株单孢分离同一时期的菌体都配制成孢子浓度为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106个孢子/mL的悬浮液。
当大白菜苗长至3～4片真叶期时，将每个品种的1/3再均分成12份，平均分配到（18±1） ℃、（23±1）℃、（28±1）℃ 3个温度条件下的光照培养室中适应2 d，这2 d里，将培养室的温度每天上调1 ℃，之后保持不变[11，12]。将等体积的4个不同浓度的菌悬液以喷雾法分别接种于同一品种4份大白菜苗上，盖上保鲜膜保湿24～48 h后揭掉保鲜膜，诱导发病，接种后于每天早中晚各浇水1次，于接种后第4、7、10、14和18天进行病情调查[6]。
当剩余的大白菜苗长至5～6片真叶期时，再将每个品种的1/2搬回培养室进行同样的接种处理。待最后剩余的一批大白菜苗长至7～8片真叶期时，也对其进行同样的接种处理。
试验因素以及水平见表1。
1.4 病情指数分级
真叶期接种鉴定调查分级标准[13]：0级，无病；1级，接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级，接种叶生直径3 mm以下的退绿斑，无霉层；5级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片；9级，接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。
1.5 抗病性划分
病情分级调查后，计算病情指数：
病情指数=[Σ（病级数×该病级发病株数）/（最高发病级数×总调查株数）]×100[10]。
根据发病程度进行分级[13]。免疫（I），病情指数=0；高抗（HR），病情指数=0.10～11.11；抗病（R），病情指数=11.12～33.33；中抗（MR），病情指数=33.34～55.55；感病（S），病情指数=55.56～77.77；高感（HS），病情指数=77.78～100。
1.6 数据处理
所有数据均采用SPSS 11.5软件（LSD，P<0.05）处理，采用Microsoft Office Excel 2003进行制图。
2 结果与分析
2.1 接种天数对抗性表现的影响
由于在接种后第4天和第7天时大白菜苗的感病情况不太明显，而接种后第14天和第18天，多数大白菜苗因生理原因导致整株枯死，无法判断其发病情况，因而在这4个时期进行病情调查时所得到的数据有残缺或不准确，不能代表各个品种的大白菜苗的感病情况；而在接种后第10天时，这两方面的问题相对而言比较小，调查所得的数据比较全面，这也与严红等[14]的研究相符。因此，最终选择用接种后第10天调查所得的数据进行制图分析。
2.2 接种浓度对抗病性表现的影响
从图1可看出，随着接种物浓度的增加，其发病程度也相应加强。当接种物浓度为1.0×103个孢子/mL时，由于其中某些品种的抗性比较强，发病程度比较轻，而某些品种的抗性较弱，发病较重，不能进行正确的抗性评价；而当接种物浓度为1.0×106个孢子/mL时，6个品种都严重发病，且基本无差异，也不能进行正确的抗性评价；当接种物浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL时，植株发病比较重且有差异，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为评价的浓度。
2.3 接种苗龄对抗病性表现的影响
从图2可以看出，随着苗龄的增大，植株发病程度有所下降，整体的抗病性在增强。当苗龄为5～6片真叶或7～8片真叶时，植株发病程度普遍较低且差异不大，不能进行正确的评价；当苗龄为3～4片真叶时，抗病性强的品种与抗病性弱的品种间的差异非常明显，可作为抗病性鉴定评价的苗龄。
2.4 接种温度对抗病性表现的影响
由图3可以看出，温度与植株发病程度呈正相关。当环境温度为（20±1）℃时，多数品种的发病程度都比较低，不能进行正确的评价；当环境温度为（30±1）℃时，6个品种发病程度都比较严重，且品种间的抗性差异与浓度和苗龄不一致，也不能进行正确的抗性评价；当环境温度为（25±1）℃时，品种间的发病程度比较明显且与浓度和苗龄的一致，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为抗性评价的温度。
3 结论
本研究结果表明，在（25±1） ℃光照培养室内，选择浓度为1.0×104～1.0×105个孢子/mL的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗，保湿24～48 h，10 d后进行病情调查，可对大白菜种质资源抗黑斑病的级别进行正确评价。
参考文献：
[1] 刘纪书.河北省蔬莱学会论文集[A].1988.174.
[2] 何启伟，吴春燕，宋廷宇.大白菜良种繁殖技术[J].长江蔬菜，2007（6）：31-33.
[3] 张百俊，张国英，杨东平，等.大白菜主要病害无公害防治技术[J].长江蔬菜，2009（15）：18-19.
[4] 李明远.十字花科蔬菜黑斑病识别与防治[J].当代蔬菜，2004（10）：34-35.
[5] 张凤兰，徐家炳，严 红，等.大白菜苗期对黑斑病抗性遗传规律的研究[J].华北农学报，1997，12（3）：115-119.
[6] 刘 影，马海霞，杨信东.白菜黑斑病空间分布型研究及杀菌剂筛选[J].北方园艺，2008（10）：171-174.
[7] 李明远.大白菜黑斑病的发生与防治[J].中国蔬菜，2006（7）：49-50.
[8] 樊慕贞，崔丽珍.白菜黑斑病的发生和化学防治研究[J].河北农业大学学报，1987，10（1）：53-61.
[9] 柯桂兰，刘焕然，赵稚雅.大白菜黑斑病病原种群组成及人工接种抗性鉴定[J].西北农业学报，1998（3）：92.
[10] 方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社，1998.
[11] 杨晓红，刘天文.大白菜抗软腐病接种鉴定及抗源筛选研究[J].山东农业科学，2009（5）：67-69.
[12] KUNDU S，PATRA M，SAMADDAR K R.Factors affecting growth and sporulation of Alternaria brassicicola[J].Journal of Mycopathological Research，1991，29（1）：17-22.
[13] 王凤敏，张鲁刚.春夏大白菜黑斑病病原鉴定和抗性鉴定方法比较[J].植物保护学报，2007，12（6）：614-618.
[14] 严 红，李明远，柯常取.大白菜苗期接种黑斑病菌保湿时间及调查期对症状表现的影响[J].北京农业科学，1994，12（4）
关键词：大白菜（Brassica campestris L. ssp pekinensis （Lour.） Olsson）；黑斑病（Alternaria brassicae）；苗期；抗性鉴定
Study on Resistance Identification Method for Black Spot of Chinese Cabbage at Seedling Stage in Laboratory
GAN Cai-xia1，ZHU Hua2，CUI Lei1，YUAN Wei-ling1，GAO Xiang1，FU Yi-bin1，MEI Shi-yong1
（1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China；
2. Wuhan Vegetable Technical Service Station， Wuhan 430012，China）
Abstract： In order to provide technical support for breeding new varieties and germplasm innovation of Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.） Olsson） with resistance to black spot（Alternaria brassicae）， the influence of inoculation spore concentration， seedling stage and temperature on black spot occurrence was studied with six varieties. It was showed that by spraying 1.0×104 pfu/mL or 1.0×105 pfu/mL spore suspension on seedling at 3～4 leaf stage and then moisturizing for 24～48 h at （25±1）℃ in door， the resistance of radish varieties on the black spot could be accurately evaluated 10 d after inoculation.
Key words： Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp pekinensis（Lour.）Olsson）；black spot（Alternaria brassicae）；seedling stage； resistance identification
大白菜黑斑病是由链格孢属真菌所致的一种常发性病害，病原菌包括芸薹链格孢（Alternaria brassicae （Berk.） Sacc.），甘蓝链格孢（A. brassicicola）和萝卜链格孢（A. japonica）3个种，其中秋冬白菜黑斑病一般由芸薹链格孢引起，而春夏白菜黑斑病则主要由甘蓝链格孢引起，是一种世界性的重要病害，最早于1836年在甘蓝上发现，1934年开始有为害大白菜的记录[1]。大白菜黑斑病主要通过种子传代形成异地扩散和蔓延，危害叶片和整株植物，全生育过程发病，严重影响白菜产量和质量，成为大白菜生产的主要病害之一，尤其在美国、芬兰、加拿大、中国台湾发生较重[2，3]。我国最早在1919年于广东省的甘蓝上发现，1937年江苏报道其为害大白菜。20世纪70年代末，黑斑病在我国大白菜等十字花科蔬菜上逐渐严重起来[4]。
大白菜黑斑病主要危害叶片、叶柄及种荚。在真叶上，最初形成圆形退绿斑，病斑扩大后转为暗黑色。全株叶片由外向内干枯，有明显较稀的同心轮纹，边缘有黄色晕环。潮湿时病斑有一层黑霉。近年来，随着春大白菜、早秋大白菜的发展，黑斑病病害问题日益突出，抗病育种是解决大白菜黑斑病经济而又有效的途径，而抗性鉴定则是抗病育种的基础[5]。
国内外对白菜黑斑病的研究主要集中在黑斑病的发生和危害、寄主植物的抗性、流行病学因素、病原物生物学特性和病原物毒素研究及综合防治等方面[6]。对于白菜黑斑病，北京市植保所李明远[7]进行了广泛深入的研究。1989年樊慕贞等[8]对河北省白菜黑斑病发生规律及防治进行了研究。而对白菜黑斑病鉴定方法的研究目前还比较少见，急需一种快速、简便而又精确的抗性鉴定方法，对我国大白菜种质资源进行筛选，以期建立简单、快速的品种选育流程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试黑斑病菌种（BHB）采自湖北省农业科学院蔬菜科技中心试验基地。菌种接种前用PDA碳源减半（马铃薯200 g，葡萄糖/蔗糖5 g，琼脂15 g，pH 7.0，去离子水1 000 mL） 固体培养基进行培养。
供试大白菜品种为湖北省农业科学院蔬菜科技中心提供，分别为品种1、品种2、品种3、品种4、品种5、品种6六种类型大白菜品种。
将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆（8 cm×8 cm）内，出苗后每盆留1～3株。
1.2 试验方法
1.2.1 环境的选择 在抗病育种过程中，大田期对黑斑病进行抗性鉴定往往由于气候条件不适宜发病而无法进行，而苗期在室内进行鉴定则温湿度条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。为此，进行了室内苗期鉴定萝卜黑斑病抗性的研究，以找出更适于苗期抗病性鉴定的方法，确定苗期黑斑病适宜的诱导发病条件，并用筛选出的最适方法对大白菜种质资源进行苗期抗病性鉴定和分级，获得抗黑斑病材料。
1.2.2 影响因素的选择 为选择一个好的抗性鉴定方法，根据各国学者在这方面进行了系统研究，即选择从接种物浓度、苗龄、环境温度等各方面探讨影响大白菜黑斑病抗性鉴定的因素[9]。
1.2.3 接种方法的选择 接种方法包括拌种法、浸种法、土壤接种法、蘸根接种法、根部切伤接种法、喷雾法和针刺法[10]。在确定以接种物浓度、苗龄和温度这3个因素为变量的情况下，选择喷雾法对大白菜苗进行接种。
1.3 接种
将BHB菌株单孢分离同一时期的菌体都配制成孢子浓度为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106个孢子/mL的悬浮液。
当大白菜苗长至3～4片真叶期时，将每个品种的1/3再均分成12份，平均分配到（18±1） ℃、（23±1）℃、（28±1）℃ 3个温度条件下的光照培养室中适应2 d，这2 d里，将培养室的温度每天上调1 ℃，之后保持不变[11，12]。将等体积的4个不同浓度的菌悬液以喷雾法分别接种于同一品种4份大白菜苗上，盖上保鲜膜保湿24～48 h后揭掉保鲜膜，诱导发病，接种后于每天早中晚各浇水1次，于接种后第4、7、10、14和18天进行病情调查[6]。
当剩余的大白菜苗长至5～6片真叶期时，再将每个品种的1/2搬回培养室进行同样的接种处理。待最后剩余的一批大白菜苗长至7～8片真叶期时，也对其进行同样的接种处理。
试验因素以及水平见表1。
1.4 病情指数分级
真叶期接种鉴定调查分级标准[13]：0级，无病；1级，接种叶生褐色小点，无退绿斑；3级，接种叶生直径3 mm以下的退绿斑，无霉层；5级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片；7级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片；9级，接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。
1.5 抗病性划分
病情分级调查后，计算病情指数：
病情指数=[Σ（病级数×该病级发病株数）/（最高发病级数×总调查株数）]×100[10]。
根据发病程度进行分级[13]。免疫（I），病情指数=0；高抗（HR），病情指数=0.10～11.11；抗病（R），病情指数=11.12～33.33；中抗（MR），病情指数=33.34～55.55；感病（S），病情指数=55.56～77.77；高感（HS），病情指数=77.78～100。
1.6 数据处理
所有数据均采用SPSS 11.5软件（LSD，P<0.05）处理，采用Microsoft Office Excel 2003进行制图。
2 结果与分析
2.1 接种天数对抗性表现的影响
由于在接种后第4天和第7天时大白菜苗的感病情况不太明显，而接种后第14天和第18天，多数大白菜苗因生理原因导致整株枯死，无法判断其发病情况，因而在这4个时期进行病情调查时所得到的数据有残缺或不准确，不能代表各个品种的大白菜苗的感病情况；而在接种后第10天时，这两方面的问题相对而言比较小，调查所得的数据比较全面，这也与严红等[14]的研究相符。因此，最终选择用接种后第10天调查所得的数据进行制图分析。
2.2 接种浓度对抗病性表现的影响
从图1可看出，随着接种物浓度的增加，其发病程度也相应加强。当接种物浓度为1.0×103个孢子/mL时，由于其中某些品种的抗性比较强，发病程度比较轻，而某些品种的抗性较弱，发病较重，不能进行正确的抗性评价；而当接种物浓度为1.0×106个孢子/mL时，6个品种都严重发病，且基本无差异，也不能进行正确的抗性评价；当接种物浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL时，植株发病比较重且有差异，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为评价的浓度。
2.3 接种苗龄对抗病性表现的影响
从图2可以看出，随着苗龄的增大，植株发病程度有所下降，整体的抗病性在增强。当苗龄为5～6片真叶或7～8片真叶时，植株发病程度普遍较低且差异不大，不能进行正确的评价；当苗龄为3～4片真叶时，抗病性强的品种与抗病性弱的品种间的差异非常明显，可作为抗病性鉴定评价的苗龄。
2.4 接种温度对抗病性表现的影响
由图3可以看出，温度与植株发病程度呈正相关。当环境温度为（20±1）℃时，多数品种的发病程度都比较低，不能进行正确的评价；当环境温度为（30±1）℃时，6个品种发病程度都比较严重，且品种间的抗性差异与浓度和苗龄不一致，也不能进行正确的抗性评价；当环境温度为（25±1）℃时，品种间的发病程度比较明显且与浓度和苗龄的一致，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为抗性评价的温度。
3 结论
本研究结果表明，在（25±1） ℃光照培养室内，选择浓度为1.0×104～1.0×105个孢子/mL的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗，保湿24～48 h，10 d后进行病情调查，可对大白菜种质资源抗黑斑病的级别进行正确评价。
参考文献：
[1] 刘纪书.河北省蔬莱学会论文集[A].1988.174.
[2] 何启伟，吴春燕，宋廷宇.大白菜良种繁殖技术[J].长江蔬菜，2007（6）：31-33.
[3] 张百俊，张国英，杨东平，等.大白菜主要病害无公害防治技术[J].长江蔬菜，2009（15）：18-19.
[4] 李明远.十字花科蔬菜黑斑病识别与防治[J].当代蔬菜，2004（10）：34-35.
[5] 张凤兰，徐家炳，严 红，等.大白菜苗期对黑斑病抗性遗传规律的研究[J].华北农学报，1997，12（3）：115-119.
[6] 刘 影，马海霞，杨信东.白菜黑斑病空间分布型研究及杀菌剂筛选[J].北方园艺，2008（10）：171-174.
[7] 李明远.大白菜黑斑病的发生与防治[J].中国蔬菜，2006（7）：49-50.
[8] 樊慕贞，崔丽珍.白菜黑斑病的发生和化学防治研究[J].河北农业大学学报，1987，10（1）：53-61.
[9] 柯桂兰，刘焕然，赵稚雅.大白菜黑斑病病原种群组成及人工接种抗性鉴定[J].西北农业学报，1998（3）：92.
[10] 方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社，1998.
[11] 杨晓红，刘天文.大白菜抗软腐病接种鉴定及抗源筛选研究[J].山东农业科学，2009（5）：67-69.
[12] KUNDU S，PATRA M，SAMADDAR K R.Factors affecting growth and sporulation of Alternaria brassicicola[J].Journal of Mycopathological Research，1991，29（1）：17-22.
[13] 王凤敏，张鲁刚.春夏大白菜黑斑病病原鉴定和抗性鉴定方法比较[J].植物保护学报，2007，12（6）：614-618.
[14] 严 红，李明远，柯常取.大白菜苗期接种黑斑病菌保湿时间及调查期对症状表现的影响[J].北京农业科学，1994，12（4）